domingo, 14 de febrero de 2016

Shigeki Watanabe o la revolución de la microscopía electrónica



El reciente premio Eppendorf 2015, Shigeki Watanabe, ha revolucionado la microscopía electrónica con su técnica del "destello y la congelación" ("flash and freeze"). 

Se trata de una técnica optogenética de congelación de alta presión. La actividad sináptica es extremadamente rápida (1 microsegundo). Surgen dos problemas para la visualización de la misma: el tamaño y la velocidad de las sinapsis. La sinapsis es demasiado pequeña para ser visualizada mediante microscopios de luz convencionales. Las sinapsis en muchos organismos pueden alcanzar unos pocos cientos de nanómetros de diámetro, y las vesículas sinápticas tienen entre 30 y 40 nm de diámetro; estos tamaños están muy por debajo del límite de resolución del microscopio óptico. Por lo tanto, la imagen óptima de una sinapsis solo puede conseguirse mediante microscopía electrónica. La velocidad es el segundo obstáculo para la medición de los procesos biológicos celulares. Hasta hace poco, los métodos eran demasiado lentos para capturar y fijar tales eventos celulares. Parecía casi imposible capturar el momento de la fusión entre vesículas y membranas. Para superar esta limitación, Heuser y Reese desarrollaron la congelación basada en el uso de un bloque de metal enfriado a 4° K por helio líquido, capturando la secuencia temporal de la fusión de vesículas con un milisegundo de resolución temporal. Pero la técnica solo permitía trabajar con preparados disecados de neuronas o tejidos muy delgados. Para aplicar métodos de congelación rápida para diferentes organismos, dos mejoras eran necesarias: el aumento de la profundidad de congelación y la estimulación fisiológica in vivo. En los últimos años, un método de congelación de alta presión se ha desarrollado para mejorar la profundidad de congelación. Normalmente, cuando el agua líquida se enfría a temperatura de congelación, las moléculas de agua empiezan a formar hielo en un tipo de cristal. Cuando se forman los cristales de hielo, la concentración local altera la presión osmótica, provocando la ruptura de las membranas celulares. Debido a la mala conductividad calorífica del agua, la velocidad de congelación de tejido de 10 micras de profundidad es muy lento, y por lo tanto las muestras gruesas (> 10 micras) acaban formando cristales de hielo. Sin embargo, a 2.100 bar (1 bar = presión atmosférica a nivel del mar), el agua puede ser enfriada a -90 ° C. En estas condiciones, la velocidad de congelación de -100 ° C  es suficiente para vitrificar el agua. Por lo tanto, mediante la congelación bajo alta presión, tejidos biológicos tan gruesos como de 500 micras se pueden congelar con una formación reducida de de cristales de hielo. En principio, la formación de imágenes resuelta en el tiempo a través de microscopía electrónica se puede realizar en animales intactos tales como Caenorhabditis elegans utilizando congelación de alta presión. Sin embargo, las neuronas en los animales intactos no son fácilmente accesibles por un electrodo. Por lo tanto, se debe buscar un método de estimulación alternativa. En la última década, las técnicas de optogenética se han desarrollado para aplicar la estimulación no invasiva a las neuronas. Por desgracia, las configuraciones actuales de los congeladores de alta presión disponibles en el mercado no permiten la estimulación de la luz de las muestras. Watanabe ha desarrollado un dispositivo de congelación de alta presión. El dispositivo puede conservar los cambios morfológicos que se producen durante la neurotransmisión con una resolución temporal de milisegundos. La canalrodopsina es un canal catiónico de un solo componente activado por la luz procedente de algas unicelulares que es capaz de estimular las neuronas.  Las células que son naturalmente sensible a la luz tales como las células de varilla o de cono en la retina pueden ser estudiadas utilizando este método.  En resumen, estos métodos pueden capturar la dinámica celular con resolución espacial de nanómetros y resolución temporal de milisegundos.