El reciente premio Eppendorf 2015, Shigeki Watanabe, ha revolucionado la microscopía electrónica con su técnica del "destello y la congelación" ("flash and freeze").
Se trata de una técnica optogenética de congelación de alta presión. La actividad sináptica es extremadamente rápida (1 microsegundo). Surgen dos
problemas para la visualización de la misma: el tamaño y la velocidad de las sinapsis.
La sinapsis es demasiado pequeña para ser visualizada mediante microscopios de luz convencionales. Las sinapsis en muchos organismos pueden alcanzar unos pocos cientos de nanómetros de diámetro, y las
vesículas sinápticas tienen entre 30 y 40 nm de diámetro; estos tamaños están muy por debajo del límite de resolución del microscopio óptico. Por lo tanto, la imagen óptima de una sinapsis solo puede conseguirse mediante microscopía
electrónica. La velocidad es el segundo obstáculo para la medición de los
procesos biológicos celulares. Hasta hace poco, los métodos eran demasiado lentos
para capturar y fijar tales eventos celulares. Parecía casi imposible capturar el momento de
la fusión entre vesículas y membranas. Para superar esta
limitación, Heuser y Reese desarrollaron la congelación basada en el uso de un bloque de metal enfriado a 4°
K por helio líquido, capturando la secuencia temporal de la fusión de vesículas con un milisegundo de resolución temporal. Pero la técnica solo permitía trabajar con preparados disecados de neuronas o tejidos muy delgados. Para aplicar métodos de congelación rápida para
diferentes organismos, dos mejoras eran necesarias: el aumento de la
profundidad de congelación y la estimulación
fisiológica in vivo. En los últimos años, un método de congelación de alta
presión se ha desarrollado para mejorar la profundidad de congelación.
Normalmente, cuando el agua líquida se enfría a temperatura de congelación, las
moléculas de agua empiezan a formar hielo en un tipo de cristal. Cuando se forman los cristales de hielo, la
concentración local altera la presión osmótica, provocando la ruptura de las membranas celulares. Debido a la mala conductividad calorífica del agua, la velocidad de
congelación de tejido de 10 micras de profundidad es muy lento, y por lo tanto las
muestras gruesas (> 10 micras) acaban formando cristales de hielo. Sin embargo, a 2.100 bar (1 bar = presión atmosférica a
nivel del mar), el agua puede ser enfriada a -90 ° C. En estas
condiciones, la velocidad de congelación de -100 ° C es suficiente para
vitrificar el agua. Por lo tanto, mediante la congelación bajo alta
presión, tejidos biológicos tan gruesos como de 500 micras se pueden congelar con una formación reducida de de cristales de hielo. En principio, la formación de imágenes resuelta
en el tiempo a través de microscopía electrónica se puede realizar en animales
intactos tales como Caenorhabditis elegans utilizando congelación de alta
presión. Sin embargo, las neuronas en los animales intactos no son fácilmente accesibles por un electrodo. Por lo tanto, se debe
buscar un método de estimulación alternativa. En la última década, las técnicas
de optogenética se han desarrollado para aplicar la estimulación no invasiva a
las neuronas. Por desgracia, las configuraciones actuales de los congeladores
de alta presión disponibles en el mercado no permiten la estimulación de la luz
de las muestras. Watanabe ha desarrollado un dispositivo de congelación de alta presión. El dispositivo puede conservar los cambios
morfológicos que se producen durante la neurotransmisión con una resolución
temporal de milisegundos. La canalrodopsina es un canal catiónico de un solo componente activado por la luz procedente de algas unicelulares que es capaz de estimular las neuronas. Las células que son naturalmente sensible a
la luz tales como las células de varilla o de cono en la retina pueden ser
estudiadas utilizando este método. En resumen, estos métodos
pueden capturar la dinámica celular con resolución espacial de nanómetros y
resolución temporal de milisegundos.
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